Она должна быть свободна от примеси веществ, могущих оказать вредное влияние на жизнеспособность трепонем. Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой, не применяя никаких дезинфицирующих средств. Смесители стерилизуют в автоклаве, подсушивают в сушильном шкафу.
Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возможность ставить реакцию иммобилизации всюду, где имеются квалифицированный персонал и возможность содержать кроликов. Этот метод можно использовать также с другими питательными средами.
Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП) Приводится по методическим рекомендациям, составленным Г.П. Авдеевой (Узбекский научно-исследовательский кожно-венерологический институт). основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.
Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее колбы, пробирки, пипетки, предметные стекла, загрязненные антигеном. Готовят также почкообразный тазик, заливаемый на 2/3 дистиллированной водой, куда складывают покровные стекла после работы. Приготовление препарата для подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате можно получить недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же после центрифугирования, так как при длительном стоянии пробирок (15-24 ч) возможны ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную жидкость берут микропипеткой объемом 0,1 мл.
Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при температуре 55-56°С в течение 30 мин.
В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса. Здоровым кроликам интратестикулярно вводят по 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболией, вводя 20 см3 воздуха в ушную вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. После этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных трепонем. Для этого микропи-геткой из пробирки наливают 0,01 мл на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает 100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и производят встряхивание в шюттель-аппарате в течение 50 мин. Первую порцию взвеси бледных трепонем уничтожают (она не может быть использована в качестве антигена). Вторую порцию жидкости, полученную при экстрагировании, отсасывают стерильной пипеткой, разливают в химические пробирки и снова определяют в ней число бледных трепонем в поле зрения. При наличии в этой порции жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в поле зрения. После каждого экстрагирования жидкость из колбочки отсасывают пипеткой в стерильные химические пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в течение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в темном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изготовления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количество бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содержать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества антигена делается в день постановки реакции. Например, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных потерь).
Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроцитов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроцитов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).
Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.
Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113
Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возможность ставить реакцию иммобилизации всюду, где имеются квалифицированный персонал и возможность содержать кроликов. Этот метод можно использовать также с другими питательными средами.
Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП) Приводится по методическим рекомендациям, составленным Г.П. Авдеевой (Узбекский научно-исследовательский кожно-венерологический институт). основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.
Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее колбы, пробирки, пипетки, предметные стекла, загрязненные антигеном. Готовят также почкообразный тазик, заливаемый на 2/3 дистиллированной водой, куда складывают покровные стекла после работы. Приготовление препарата для подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате можно получить недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же после центрифугирования, так как при длительном стоянии пробирок (15-24 ч) возможны ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную жидкость берут микропипеткой объемом 0,1 мл.
Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при температуре 55-56°С в течение 30 мин.
В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса. Здоровым кроликам интратестикулярно вводят по 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболией, вводя 20 см3 воздуха в ушную вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. После этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных трепонем. Для этого микропи-геткой из пробирки наливают 0,01 мл на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает 100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и производят встряхивание в шюттель-аппарате в течение 50 мин. Первую порцию взвеси бледных трепонем уничтожают (она не может быть использована в качестве антигена). Вторую порцию жидкости, полученную при экстрагировании, отсасывают стерильной пипеткой, разливают в химические пробирки и снова определяют в ней число бледных трепонем в поле зрения. При наличии в этой порции жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в поле зрения. После каждого экстрагирования жидкость из колбочки отсасывают пипеткой в стерильные химические пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в течение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в темном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изготовления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количество бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содержать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества антигена делается в день постановки реакции. Например, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных потерь).
Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроцитов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроцитов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).
Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.
Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113